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淺論生命科學技術病證結合研究中的作用

來源:原創論文網 添加時間:2018-08-17

  摘要:病證結合研究是目前中西醫結合研究的主要思路與方法。病證結合體現了中西醫2種醫學的優勢互補,通過多學科交叉探討病證之間的關系,研究疾病證候診斷及辨證施治規律等。得益于現代生命科學技術的發展,病證結合研究取得了長足的進步。本文主要介紹了近年來數據挖掘技術、系統生物學技術、表觀遺傳學技術、網絡生物學技術在病證結合研究中的應用和發展前景,為進一步研究和臨床應用提供思路和方法。

  關鍵詞:病證結合; 中西醫結合; 技術應用; 綜述;

生命科學論文 配圖

  中醫的“證”是對機體在疾病發展中某一階段的病理概括,而西醫所診斷的“病”是指人體在受到致病因素作用后,在體內出現的具有一定發展規律的病理演變全過程,二者相互交叉,同一疾病在不同發展階段會出現不同證候,同一證候又會出現在不同疾病中。病證結合研究是把中醫的證放在疾病背景下研究,是多種理論的相結合及囊括多種診療措施的現代病證結合的新模式,對提高臨床診療水平具有重要意義。

  病證結合研究的關鍵任務是解決證候分類的客觀化、證候的分子生物學基礎及證候的發生演變的內在機制等問題。近年來病證結合研究取得較大進展,這與生命科學技術及分析技術的發展是同步的。這些新技術主要包括數據挖掘技術、系統生物學技術、表觀遺傳學技術及生物網絡技術等。茲就相關技術在病證結合研究領域的應用作一綜述。

  1 數據挖掘技術

  數據挖掘是利用統計分析和人工智能等新技術以分析數據庫中的數據,尋找其規律性,提取出事先未知而潛在有用的信息。其代表方法有多元統計、聚類分析、關聯分析、決策樹、神經網絡、貝葉斯網絡和潛在結構模型等。因傳統中醫證候診斷主觀性強,病證原始數據的獲得過程中可能混雜不規范數據或噪聲數據,導致眾多臨床資料中隱藏著大量的信息[1] ,其辨證過程也缺乏客觀的衡量依據,不能為科學實驗提供客觀診斷[2] 。數據挖掘技術以其善于處理非線性復雜數據、挖掘數據內在規律而在中醫證候研究中受到廣泛的關注,在中醫證候模型的建立方面具有一定的優勢[3] 。

  有研究者運用數據包絡分析法對中醫證候進行“序列化”,拋棄以往對證候數據的無序挖掘,利用證候的發生、演變、轉歸等規律進行建模[4] 。隱結構模型可通過客觀資料的分析,揭示證候發生與共生的規則,獲得復雜分類標準。而在具有先驗知識的前提下,貝葉斯網絡進行證候分類的正確率較高。關聯規則算法在對數據進行分析,從中找到證候元素對證型判別的貢獻權重,形成“證候元素-證型”診斷量表[5-7] 。而且,中醫“病證結合”的研究應重視以“證”為研究單位,引進微觀辨證的研究成果,綜合運用不同的智能算法進行數據挖掘,才能達到最佳的證候診斷效果。

  2 系統生物學技術

  系統生物學是以系統理論為指導,研究一個生物系統中所有組成成分(基因、蛋白質等)的構成,以及在特定條件下這些組分間相互關系的科學。系統生物學的“涌現”特性與中醫的整體觀異曲同工,利用組學技術檢測機體的生物學物質基礎,進而整合這些生物信息,進而探索和闡明機體物質組學的整體變化,這為病證結合研究提供了新的研究思路[8] 。系統生物學技術主要包括基因組學技術、轉錄組學技術、蛋白質組學技術以及代謝組學技術等,將這些組學技術運用到病證結合研究中,得到病證相關指紋圖譜,獲取證候相關生物標志物,極大地推進了病證結合研究的進展。

  2.1 基因組學/轉錄組學技術

  基因組學技術主要是對生物體內所有基因進行繪圖、核苷酸序列分析及基因功能分析,研究基因組的表達、基因的多樣性、基因組功能的闡釋及蛋白質產物的功能等的技術。包括基因芯片、測序等各種高通量技術以及實時熒光PCR等定量分析技術。轉錄組學是功能基因組學的重要組成部分,是在整體水平上研究基因全部轉錄本種類、結構和功能及轉錄調控規律的學科。

  證候作為機體對致病因素的反應,不僅與致病因素的性質和強弱有關,更與患者個體的體質因素有關,而基因組學認為基因序列的多態性及基因表達的差異又決定了個體差異,可以認為基因及其表達的改變是證的“內涵”。所以,運用基因芯片、測序等技術以發現不同證候基因序列的多態性及表達譜之間的差異,從而確定證候相關基因,有助于證候精確診斷[9] 。迄今的研究顯示病證的基因組學研究主要包含2個層次,即證候的單核苷酸多態性研究和證候的基因表達譜研究。

  2.1.1 證候基因多態性研究

  二代測序或大規模并行測序的出現,將各種分析和篩選輕松升級。技術革新使測序數據的數量和質量不斷攀升。運用基因測序技術,檢測不同證候患者基因序列,通過比較得出疾病相關基因多態性與證候之間的聯系,有利于中醫證候分型研究[10] 。Zhou等[11] 利用Affymetrix SNP芯片對12個腎陽虛及3個非腎陽虛患者進行單核甘酸多態性檢測,發現腎陽虛證有5處(包括DCDC5基因)發生連鎖失衡單核苷酸多態性變化,并證實DCDC5基因及其旁邊其他基因單核甘酸多態性與腎陽虛證有關。Li等[12] 利用SNa P shot Assay研究扶正化瘀方對乙型肝炎肝硬化患者CYP1A2基因多態性的影響,結果表明扶正化瘀方對乙肝肝硬化證候組的作用與CYP1A2-G2964A位點基因多態性有關。

  目前三代測序技術(即單分子測序技術)逐漸發展起來,與二代測序技術相比,單分子測序技術具有更加快速、簡便、讀長更長、分辨率也更高的特點,且單分子測序技術可直接對RNA進行測序,即檢測細胞和組織內基因表達水平,同時對基因的結構做出分析,這會大大促進對病證基因表達譜的研究。另外,三代測序技術可檢測出基因的甲基化,為病證的表觀遺傳調控的研究打開了一條通路 。

  2.2 蛋白組學技術

  蛋白質組學技術是以蛋白質組為研究對象,分析細胞內蛋白質的組成成分、表達水平與修飾狀態的動態變化,了解蛋白質之間的相互作用與聯系,在整體水平上研究蛋白質組成與調控的活動規律的技術。蛋白質組學動態、宏觀、整體和綜合特點與中醫證候具有的波動性、整體性、時序性、可預測性和標志性極其相似,有利于動態的揭示同一個研究對象不同時期的變動性,更符合病證的特點[18] 。常用的蛋白組學技術包括二位凝膠電泳技術、多位液相色譜技術、質譜技術及蛋白芯片技術等。

  運用蛋白質組學技術對同病異證或異病同證患者的組織和細胞蛋白質進行分析研究,可揭示疾病發生發展變化過程中蛋白質的差異表達。因此,蛋白質組學技術能夠成為揭示中醫證候變化以及藥物作用靶點物質和功能基礎的重要手段,并且在此基礎上可以建立疾病證候的蛋白質數據庫[19] 。

  有研究者對子宮內膜異位癥(EMT)不同證候患者增生期在位和異位內膜組織和增生期正常子宮內膜組織標本提取組織總蛋白,并通過雙向電泳技術輔助激光解吸電離飛行時間質譜及蛋白質數據庫檢索進行蛋白質鑒定。結果顯示EMT不同證候之間蛋白質組成分存在差異。推測這些差異可能是證候實質的內在根源,可能成為EMT不同證候發病的候選生物標志物[20] 。Song等[21] 運用SELDI蛋白芯片檢測慢乙肝虛證和實證患者的血清蛋白,并進行復雜分析,結果發現2種血清蛋白可作為慢乙肝虛證和實證的分類依據。因此,蛋白組學研究可能為病證結合診斷提供生物標志物,輔助臨床診斷,能明顯提高診斷的準確性,進而提高對證治療效果。

  2.3 代謝組學技術

  代謝組學技術是通過考察生物體系受刺激或擾動后(如將某個特異的基因或環境變化后)代謝產物的變化或其隨時間的變化,研究生物體系的代謝途徑的一種技術。常用的代謝組學技術包括核磁共振技術、氣相色譜質譜聯用技術、液相色譜質譜聯用技術等;诖x組學可以觀測生物體受到擾動后(外界刺激、環境變化或遺傳修飾)所有代謝應答的全貌和動態變化,與中醫辨證論治的整體觀和動態連續性相契合,代謝組學更有利于動態揭示證候發生演變規律。運用代謝組學技術在病證結合臨床研究中有助于早期發現疾病證候生物標志物而達到輔助臨床診斷的目的[22-23] 。該技術能通過檢測不同時間點患者的代謝組,對由疾病及對證治療引起的代謝產物的動態變化進行分析[24] 。

  3 表觀遺傳學技術

  表觀遺傳調控是指不改變基因DNA序列,而通過某種機制改變基因座或染色體狀態,并進一步影響表型的調節方式。表觀遺傳調控是復雜疾病證候本質的重要內容,是遺傳與環境共同作用的結果,對同病異證、異病同證進行表觀遺傳調控研究或許是揭示證候本質的一種途徑,表觀遺傳調控的可逆性也是中醫通過綜合方式調控的重要環節[25-26] 。表觀遺傳學調控包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNAi、染色體重塑、基因組印跡、micro RNA調控等在內的多種修飾機制。劉氏[27] 采用甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測急性髓系白血病和健康人ID4基因啟動子區甲基化狀態并進行組間及中醫證型間比較,結果顯示ID4基因啟動子區甲基化陽性表達與證候相關。由于表觀遺傳是可逆性的,因此,筆者認為消除表觀調控對基因的影響是中醫調治復雜性疾病證候的重要環節。

  micro RNA(mi R)是一類非編碼的單鏈小分子RNA,通過和靶基因m RNA堿基配對引導沉默復合體降解m RNA或抑制m RNA的翻譯,從而在轉錄后水平調控基因表達。研究表明,mi R可通過調控組蛋白修飾引起染色質重塑,導致基因表達異常[28] 。Gao等[29] 發現,mi R-17、mi R-21、mi R-181b和mi R-196a可作為胰腺癌辨證依據。Zhang等[30] 發現,血清mi R-583和mi R-663或許可作為區分乙肝肝膽濕熱證和肝腎陰虛證的標志物。雖然尚無mi R調控表觀遺傳的病證結合方面的研究,但筆者認為這將成為揭示環境對證候影響的中醫理論分子內涵的重要途經。

  4 網絡生物學技術

  網絡生物學技術是利用生物網絡(包括基因調控網絡、蛋白交互網絡、代謝和信號轉導網絡等)描述研究對象的生物學性質、分析因果關系、認識生命活動規律的一門技術。人是生物分子相互作用形成的復雜網絡,病證的發生發展是這個復雜網絡失衡導致的,單一分子及其構成的單一信號轉導通路難以反映病證機制和治療的關鍵,因此需要從整體聯系的角度,整合不同層次的信息達到對病證機制的整體理解和認知。而生物分子網絡則是該研究策略下的重要切入點[31] 。所以,把網絡生物學技術運用到病證結合研究中,有助于從分子水平綜合描述病證發展過程的復雜性及其相互之間的關聯關系,以及尋找辨證選方的中藥方劑作用的靶標。

  4.1 基于生物分子網絡的“病-證”關系研究

  生物分子網絡主要是指基因、基因產物和代謝物等生物分子之間通過復雜相互作用而形成的網絡,也可拓展到以生物分子為基礎的信號通路網絡、代謝網絡、生物過程網絡、組織網絡等。而融合文獻挖掘與基因表達譜分析、構建特定“病-證”生物分子網絡是用于分析同病異證、異病同證分子基礎的前提條件。研究顯示,將分子生物網絡運用到病證結合研究,不僅能進一步理解寒熱、血瘀等不同證候之間的關系,還可從分子層面對疾病“辨證論治”及藥物與疾病之間“同病異治”“異病同治”的研究提供實驗依據[32] 。Lu等[33] 將“病-證”的關系置于生物分子網絡的背景下進行比較分析,探討了慢性乙型肝炎和肝硬化“同病異證”“異病同證”的分子機制。

  4.2 基于網絡藥理學的辨證論治研究

  網絡藥理學是建立在疾病-基因-藥物的多層次網絡基礎上,從整體上預測藥物靶點、提高藥物發現效率的新興學科[34] 。辨證施治是中醫治療學的精華,也是中醫藥個性化治療的主要表現。運用網絡藥理學方法研究病-證-方對應關系,可以揭示疾病、證候、方藥之間的內在聯系及網絡調控機理,從而更深入把握辨證論治的精髓。有研究通過IPA軟件分別構建類風濕關節炎(RA)熱證和對證中藥靶蛋白的分子相互作用網絡,結果顯示,RA熱證的疾病狀態和對證中藥的干預靶點,都能作用在相同的細胞信號轉導通路,干預通路中的相同或不同的關鍵分子,進而影響整個通路的生物學功能。這也許就是對證中藥治療RA熱證“藥-證對應”的分子生物學機制之一。

  網絡生物學的方法應用于中醫證候及中藥復方的研究,對科學、合理的解釋中醫證候特征、證候病機演變內涵及病-證-方的相關性等中醫學最根本問題甚有裨益;另外,還可用于觀察中藥干預前后患者代謝網絡的整體變化及動態趨勢,分析干預前后生物網絡的變化,探明中藥復方干預該病證在代謝網絡層面上的功能模塊和生物靶點,從而提供研究中藥復方作用機制的新思路。

  5 展望

  開展中西醫生物醫學信息學研究,分析與挖掘病證組學數據,并進行“病-證-方/效”生物網絡的構建與分析,從而為臨床診斷和治療提供決策支持,是開展病證結合研究的主要思路。盡管上述新技術為病證結合研究提供了不少支持并取得一定成果,但尚有許多問題有待改進,如數據挖掘僅用于證候診斷量表及診斷模型的建立,且處于探索階段,并不能真正代替醫生診斷。因此,還需在建立完整的四診數據庫基礎上開發真正的人工智能診斷系統。另外,利用系統生物學技術獲得病證動態變化信息雖然反映了機體內的動態變化,但因沒有確切的診斷標準,故這種標志物指向相對的,尚不能實際用于臨床診斷。如何確立統一標準,從而為診斷治療及療效判定提供一個確切的標準是今后的研究重點。

  針對病證結合研究不斷積累的大量數據,開展基于系統生物學、生物信息學及復雜科學等多學科交叉的病證分子診斷及其調控機制研究,能為具有整體思維和個體化特征的中醫臨床證候的精確診斷和治療提供依據,促進中西醫結合學科及中西醫結合臨床精確醫療的發展,推動中醫藥大健康發展及個體化精確醫療科學前沿研究。即以個人基因組信息為基礎,結合蛋白質組、代謝組及表型組等相關內環境信息,為患者量身設計出最佳診療方案,以期達到治療效果最大化和不良反應最小化的一門定制醫療模式。因此,利用新技術開展中西醫病證結合研究將為個體化精確醫療作出巨大貢獻。

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